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技術(shù)分享：小膠質(zhì)細(xì)胞特異性研究的Hexb工具鼠
發(fā)布時(shí)間: 2022-05-24 瀏覽量： 次

存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中的髓細(xì)胞是一類異質(zhì)性的先天免疫細(xì)胞，對(duì)維持器官穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。其中，小膠質(zhì)細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的巨噬細(xì)胞（CAMs），幾乎與所有CNS疾病相關(guān)[1, 2]。它們所處位置不同且功能不同：腦實(shí)質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞位于白質(zhì)，對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元[3]和少突膠質(zhì)細(xì)胞[4]起著支持作用；而CAMs位于CNS界面，負(fù)責(zé)維護(hù)邊界的完整性。盡管如此，它們?cè)趥€(gè)體遺傳學(xué)上密切相關(guān)共享一些生理譜系特征，包括發(fā)育起源、細(xì)胞增殖過程以及髓細(xì)胞標(biāo)志物如Cx3cr1的表達(dá)等[5, 6]。然而，由于缺乏合適的工具來區(qū)分，人們對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和CAMs的特異性細(xì)胞類型特征知之甚少。


2020年6月，Nature Immunology上發(fā)表了用于小膠質(zhì)細(xì)胞特異性研究的Hexb工具小鼠[7]。研究者采用大規(guī)模平行性單細(xì)胞測(cè)序挖掘生理以及病理過程中的小膠質(zhì)細(xì)胞和CAMs的關(guān)鍵特征，發(fā)現(xiàn)Hexb的表達(dá)既能高度局限于小膠質(zhì)細(xì)胞，又能在4種不同疾病模型中穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)在CAMs中不表達(dá)，因而選取Hexb作為小膠質(zhì)細(xì)胞的核心基因。研究者后續(xù)基于Hexb開發(fā)了兩種工具小鼠用于小膠質(zhì)細(xì)胞特異性的研究。

首先是構(gòu)建HexbtdTomato小鼠，研究者通過CRISPR/Cas9技術(shù)，將T2A-tdTomato基因盒定點(diǎn)插入在內(nèi)源性Hexb基因的終止密碼前，使得表達(dá)Hexb的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)tdTomato（tdT）紅色熒光蛋白（圖一a）。在HexbtdT/tdT小鼠的生理狀態(tài)下，免疫熒光染色及3D重構(gòu)結(jié)果顯示幾乎所有CNS不同區(qū)域的Iba1+小膠質(zhì)細(xì)胞都被標(biāo)記成紅色，且在非Iba1+細(xì)胞中沒有檢測(cè)到任何異位tdT表達(dá)（圖一b-d）。相比之下，Cx3cr1GFP/+小鼠的GFP+細(xì)胞不僅標(biāo)記了小膠質(zhì)細(xì)胞，還標(biāo)記了血管周圍巨噬細(xì)胞（pvMΦ）和軟腦膜下巨噬細(xì)胞（mMΦ）（圖一e）。

技術(shù)分享：小膠質(zhì)細(xì)胞特異性研究的Hexb工具鼠(圖1)

圖一 HexbtdTomato小鼠的構(gòu)建與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記檢測(cè)[7]

研究者進(jìn)一步分析HexbtdTomato小鼠在CNS病理狀態(tài)下tdT信號(hào)的穩(wěn)定性與特異性。將HexbtdT/+Cx3cr1GFP/+小鼠實(shí)施單側(cè)面神經(jīng)軸突切斷術(shù)模擬神經(jīng)變性，結(jié)果顯示損傷一周后，tdT信號(hào)仍然局限于小鼠腦實(shí)質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞，且損傷區(qū)域的tdT陽性細(xì)胞增多（圖二a-b，實(shí)心黃色三角形）。另外，在自身免疫性腦脊髓炎的HexbtdT/+小鼠中，tdT表達(dá)也僅限于Iba1+CD206–的腦實(shí)質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞（圖二c-d，黃色箭頭）；在炎癥CNS中還發(fā)現(xiàn)tdT–Iba1+的細(xì)胞，經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)多數(shù)為L(zhǎng)y6C+細(xì)胞，推測(cè)是浸潤(rùn)的髓細(xì)胞（圖二e）。以上結(jié)果表明，生理和病理?xiàng)l件下HexbtdTomato小鼠中的小膠質(zhì)細(xì)胞均能高效且特異地被tdT標(biāo)記，該小鼠模型可用于追蹤研究小膠質(zhì)細(xì)胞的在體行為軌跡。

技術(shù)分享：小膠質(zhì)細(xì)胞特異性研究的Hexb工具鼠(圖2)

圖二 病理?xiàng)l件下HexbtdTomato小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記檢測(cè)[7]

其次是構(gòu)建HexbCreERT2小鼠，研究者通過CRISPR/Cas9技術(shù)，將CreERT2基因盒定點(diǎn)插入在內(nèi)源性Hexb基因的終止密碼前，使得表達(dá)Hexb的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CreERT2蛋白（圖三a）。CreERT2通常定位于細(xì)胞質(zhì)中，只有在他莫昔芬（TAM）誘導(dǎo)后CreERT2才會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，從而識(shí)別loxP位點(diǎn)發(fā)生基因重組。因此HexbCreERT2小鼠可用于小膠質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)型功能研究。將HexbCreERT2小鼠與報(bào)告基因小鼠R26yfp/yfp進(jìn)行交配，在陽性子代出生后第一天和第三天（P1和P3）分別注射TAM，P42小鼠經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅有小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)YFP熒光蛋白（圖三b）。結(jié)果表明TAM誘導(dǎo)的HexbCreERT2小鼠可以在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生高頻、穩(wěn)定的遺傳修飾，并且CAMs不受影響。

技術(shù)分享：小膠質(zhì)細(xì)胞特異性研究的Hexb工具鼠(圖3)

圖三 HexbCreERT2小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞特異性基因重組[7]

綜上所述，在生理和病理狀態(tài)下腦實(shí)質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞均能特異性表達(dá)Hexb基因，使得HexbtdTomato小鼠和HexbCreERT2小鼠可分別用于小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記和基因重組，為探索小膠質(zhì)細(xì)胞的特征開辟了新途徑。