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技術(shù)分享：基因治療小鼠常染色體隱性耳聾模型
發(fā)布時(shí)間: 2022-05-24 瀏覽量： 次

基因治療是指通過修復(fù)致病基因，或者導(dǎo)入正確基因而達(dá)到治療效果的手段。通常分為兩大類：ex vivo和in vivo。Ex vivo指在體外完成細(xì)胞遺傳操作修復(fù)，再將修復(fù)后的細(xì)胞輸入到人體；而in vivo指將遞送載體輸入到人體，在體內(nèi)完成細(xì)胞修復(fù)。罕見病通常為單基因病，是最適合使用基因治療攻克的疾病。相比于其他藥物，基因治療的優(yōu)勢在于從源頭上解決問題，理論上通過一次或數(shù)次治療即可攻克疾病。其中AAV遞送系統(tǒng)是現(xiàn)今基因治療所采用的主流載體。


耳聾是威脅人類健康最常見的疾病之一。在遺傳性耳聾中，非綜合征性耳聾占比70%，其中約80%是由基因突變引起[1]?，F(xiàn)已有124個(gè)非綜合征性耳聾相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，其中78個(gè)基因表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳（https://hereditaryhearingloss.org）?；蛑委煘檫z傳性耳聾的治療帶來曙光，已有多種不同策略被報(bào)道用于治療遺傳性耳聾的小鼠模型。本文將從中選取兩篇進(jìn)行介紹，主要討論采用不同基因編輯器來基因治療小鼠常染色體隱性耳聾模型。

2020年6月，Science Translational Medicine上報(bào)道了David Liu實(shí)驗(yàn)室利用胞嘧啶堿基編輯器（CBE）在體內(nèi)修復(fù)Tmc1功能失活突變c.A545G（p.Y182C）造成的常染色體隱性耳聾小鼠，恢復(fù)部分小鼠聽力[2]。研究者將堿基編輯效率最高的CBE拆成兩個(gè)部分分別裝載在兩個(gè)Anc80L65 AAVs中，雙AAVs遞送系統(tǒng)利用split-intein介導(dǎo)可在體內(nèi)恢復(fù)CBE的活性。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，雙AAVs遞送系統(tǒng)體外細(xì)胞測試正確編輯效率高達(dá)57%，并且?guī)缀鯖]有脫靶（圖一A）。在出生1天的Tmc1 c.A545G純合突變小鼠的內(nèi)耳中注射雙AAVs，盡管耳蝸毛細(xì)胞占比低于2%，但是14天后可檢測到整個(gè)耳蝸的基因組DNA成功編輯效率為2.3 ± 0.4%；同時(shí)，檢測Tmc1 mRNA有10%-51%的Tmc1 c.A545G修復(fù)成Tmc1 c.A545A（圖一B）。從掃描電鏡圖片可以看出，Tmc1 c.A545G純合突變小鼠的內(nèi)毛細(xì)胞（IHCs）和外毛細(xì)胞（OHCs）在4周齡開始死亡，從而出現(xiàn)深度耳聾（圖一D）。基因治療后4周齡小鼠的毛細(xì)胞形態(tài)與野生型相比保持正常（圖一C和E）。
技術(shù)分享：基因治療小鼠常染色體隱性耳聾模型(圖1)
圖一 雙AAVs遞送CBE的隱性耳聾小鼠基因治療效果[2]

2022年2月，Cell Research報(bào)道了基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的優(yōu)化型同源修復(fù)策略在體內(nèi)修復(fù)Klhl18lowf純合小鼠的常染色體隱性耳聾模型，恢復(fù)部分小鼠聽力[3]。Klhl18基因的p.V55F錯(cuò)義點(diǎn)突變（Chr9:110455454 C>A），會導(dǎo)致IHCs異常，從而使純合子最終表現(xiàn)為耳聾，而雜合子小鼠聽力正常[4]。Klhl18lowf純合小鼠的突變無法采用現(xiàn)有的堿基編輯器來進(jìn)行修復(fù)。雖然采用基于CRISPR/Cas9編輯器介導(dǎo)的同源修復(fù)（HR），可以實(shí)現(xiàn)任意堿基的改變以及DNA片段的插入或刪除[5]，但是HR修復(fù)方式主要發(fā)生在分裂的細(xì)胞，在活體動物組織中修復(fù)效率通常很低[6]。因此，研究者采用2017年報(bào)道的同源介導(dǎo)末端連接（HMEJ）這一修復(fù)方式[7]，來提高體內(nèi)正確基因編輯的效率（圖二）。

技術(shù)分享：基因治療小鼠常染色體隱性耳聾模型(圖2)

圖二 HMEJ介導(dǎo)修復(fù)方式[7]

研究者在體外細(xì)胞測試sgRNA編輯效率，選擇效率最高的sgRNA用于體內(nèi)基因治療實(shí)驗(yàn)，并選擇AAV9和AAV-PHP.eB進(jìn)行基因遞送。將SaCas9-KKH和sgRNA+donor分別裝載在兩個(gè)AAVs中，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)雙AAVs遞送系統(tǒng)體外細(xì)胞測試的正確編輯效率高達(dá)17.8%，并且?guī)缀鯖]有脫靶（圖三A）。在出生1天的Klhl18lowf純合小鼠的內(nèi)耳中注射雙AAVs，14天后檢測到整個(gè)耳蝸的基因組DNA成功編輯效率為0.1%，10周后可提高到0.32%（圖三B）。相關(guān)研究表明Klhl18的缺失會導(dǎo)致IHCs變得尖細(xì)，但OHCs不受影響[4]。從掃描電鏡圖片觀察到，基因治療后8周齡小鼠的IHCs細(xì)胞形態(tài)與野生型相比恢復(fù)正常（圖三C）。

技術(shù)分享：基因治療小鼠常染色體隱性耳聾模型(圖3)

圖三 雙AAVs遞送CRISPR/Cas9-HMEJ修復(fù)的隱性耳聾小鼠基因治療效果[3]

綜上所述，利用AAV遞送工具進(jìn)行基因治療，可在體修復(fù)部分常染色體隱性耳聾小鼠模型的單基因突變，恢復(fù)小鼠部分聽力。不同基因編輯工具的DNA修復(fù)效率有所不同，可根據(jù)具體基因突變位點(diǎn)的屬性來選擇最佳修復(fù)工具。針對AAV載體容量受限問題，可將基因編輯工具拆分并利用雙AAVs系統(tǒng)進(jìn)行遞送。盡管雙AAVs遞送會降低編輯效率，但在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明療效明顯。隨著這些基因治療系統(tǒng)的不斷更新，未來還可拓寬應(yīng)用到其他罕見病的研究以及轉(zhuǎn)化治療上。

參考文獻(xiàn)

1. Carpena NT, Min YL: Genetic Hearing Loss and Gene Therapy. Genomics & Informatics 2018, 16(4):e20.

2. Yeh WH, Shubina-Oleinik O, Levy JM, Pan B, Liu DR: In vivo base editing restores sensory transduction and transiently improves auditory function in a mouse model of recessive deafness. Science translational medicine 2020, 12(546):eaay9101.

3. Gu X, Hu X, Wang D, Xu Z, Wang F, Li D, Li G-l, Yang H, Li H, Zuo E et al: Treatment of autosomal recessive hearing loss via in vivo CRISPR/Cas9-mediated optimized homology-directed repair in mice. Cell Research 2022,0:1-4.

4. Ingham NJ, Banafshe N, Panganiban CH, Crunden JL, Steel KP: Inner hair cell dysfunction in Klhl18 mutant mice leads to low frequency progressive hearing loss. PLoS ONE 2021, 16(10):e0258158.

5. Cox D, Platt RJ, Zhang F: Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine 2015,21(2):121-131.

6. Yang Y, Wang L, Bell P, Mcmenamin D, He Z, White J, Yu H, Xu C, Morizono H, Musunuru K: A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nature Biotechnology 2016,34(3):334-338.

7. Yao X, Wang X, Hu X, Liu Z, Yang H: Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research 2017, 27(6):801-814.